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2020-04-09 01:03 来源:莆田养生网

基于微流控纸芯片的病原体检测方法研究进展

大连大学医学院 大连大学环境与化学工程学院

病原体的快速检测和准确鉴定在临床实验室检测、食品工业和环境监测方面至关重要,现有的细菌培养、核酸扩增和酶联免疫等病原体诊断方法或耗时费力,或需要复杂的仪器设备,不适合现场即时检测,因此,目前亟需一种快速有效检测病原体的新方法。

微流控纸芯片逐渐成为检测病原体感染的新工具,纸基微流控芯片(paper-based MIcrofluidics)或微流控纸基分析设备(microfluidic paper-based analytical device, μPADs)简称纸芯片,是由 Martinez等在2007年首次提出,其用纸张作为基底代替硅、玻璃、高聚物等材料,在纸上加工出具有一定结构的亲疏水微细通道络及相关分析器件,构建“纸上微型实验室”,可用于尿、唾液、血等多种物质的分析与检测,为初期诊断和初期医治提供了平台。纸芯片本钱低,制作简单,携带方便,可在现场采样并迅速检测分析,实现真正意义上的即时检测(point-of-care testing, POCT)。本文旨在介绍微流控纸芯片的病原体检测方法和纸芯片微流控技术的发展前景。

目前,纸芯片应用研究主要集中于医学、生物学和环境监测,根据检测原理可以把纸芯片病原体检测分为四类:比色检测、荧光检测、化学发光检测和电化学发光检测。

基于比色检测法的微流控纸芯片

比色检测法是目前纸芯片分析研究中最常见的检测方法,通过显色反应使待检测组分转化为有颜色的物资,这种检测既可直接通过肉眼辨别实现定性检测,也可采用数码相机或智能拍照、扫描仪扫描成图象,利用颜色深度与待测组分浓度的相关性来实现半定量或定量检测。比色检测根据标记物的不同可分为纸基-酶联免疫吸附实验(P-ELISA)、胶体金相关纸芯片、其他比色法纸芯片。

P-ELISA

P-ELISA将ELISA的灵敏性和特异性与低成本、易使用的纸张平台相结合,在纸上制作96微孔板进行检测。早在2010年,Cheng等首次用P-ELISA方法检测血清样品中的人类免疫缺点病毒,研究表明P-ELISA比传统ELISA法更快更便宜,但灵敏度稍差。随着检验技术的进步,目前P-ELISA不但缩短了时间,而且提高了灵敏度。Khan等利用P-ELISA检测T7噬菌体,可在30min内得出检测结果,检测范围为100~109 PFU/mL,而传统ELISA法检测时间多达几小时,检测范围为2×105~2×107 PFU/mL。Larsson等在改进的滤纸上检测M13噬菌体,其中聚电解质多层(PEM)由丙烯酸(PAA)和烯丙胺盐酸盐(PAH)组成,有利于病毒的静电吸附,该方法的检测时间AI等通过未修饰的金纳米颗粒和单链寡核苷酸杂交实现快速诊断,利用盐诱导的胶体金溶液检测结核分枝杆菌的DNA序列,不需要多个PCR循环扩增特异性DNA靶序列,无需复杂且耗时的硫醇化或其他表面修饰的制备探针的过程,制作方法简单快捷,该设计可以检测到浓度为 2.6 nmol/L的结核分枝杆菌靶序列,检测时间约为1 h,低于传统检测方法(痰涂片镜检、结核分枝杆菌培养和份子种类诊断)的检测时间。

其他比色法纸芯片

除P-ELISA、胶体金相关纸芯片以外,还有用其他比色法检测病原体的纸芯片。Murdock等在不同的缓冲液条件下,基于纸张平台进行酶底物反应,通过颜色变化定性检测甲型和乙型流感病毒,通过观察样品是不是受抗病毒药物(如达菲)的影响,实现了同步检测流感病毒的耐药性。Jokerst等在滤纸上检测食品样品中的大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增多性李斯特菌和鼠伤寒沙门菌,利用物种特异性酶与底物的相互作用,由不同颜色变化肯定3种病原菌的存在

,8~12 h内可检测浓度为10 CFU/cm2的致病菌,低于文献报道的最低限值(100 CFU/cm2),而检测食源性细菌的金标准细菌培养法需要耗时5~7 d,因此该设计为准确简便地检测多种病原菌提供了可能。

基于荧光检测法的微流控纸芯片

荧光检测法的原理是基于蛋白质、DNA以及氨基酸等生化样品本身有荧光,或可以用荧光试剂标记,激光引诱荧光进行测定,荧光强度与入射光强度、量子效力、样品浓度成正比。在微流控纸芯片检测中,荧光检测法的灵敏度高于比色检测法。Cho等通过角度特异性米氏散射量化免疫凝集的程度,用智能检测绿色荧光信号,在纸芯片上实现病原菌的免疫凝集检测,总测定时间传感器。Wang用N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)制备DNA传感器,将传感器共价固定在纸芯片上捕获DNA,核酸杂交反应后,在DNA生物传感器上捕获碳量子点标记的DNA信 号,高锰酸钾将空穴注入到碳点中,高能带中的电子与氧化剂注入空穴湮灭产生化学发光信号,终究通过分析化学发光信号的强度定量检测目标DNA,该方法灵敏度可到达8.56× mol/L,但超弱发光分析仪检测器价格昂贵,不适合现场即时检测。Liu等首先提出了电荷藕合器件(CCD)传感器与纸芯片化学发光检测的综合运用,开发了一种新型的纸基微流体化学发光DNA生物传感器,通过DNA探针和生物素标记的DNA链的杂交反应检测李斯特菌的DNA片段,使用低成本的CCD成像装置作为检测器检测发光信号,该方法所提供的DNA生物传感器分析性能好,且有助于在纸芯片上实现简单、低成本和便携式的化学发光检测,其检测范围为1.94×~1.94×104 pmol/L,检测限为6.3×pmol/L,检测限比具有CCD 检测器的其他微流控电化学DNA测定的检测限低3~5个数量级。

基于电化学发光检测法的微流控纸芯片

电化学发光法是在化学发光和电化学基础上发展起来的一种新的分析方法,是通过电驱动促使某些物质发生电化学反应构成激发态,并通过辐射光子返回基态,并对发光强度进行测量的一种分析方法,与化学发光传感器相比,电化学发光生物传感器背景信号低、分析物范围广、灵敏度高、利于实现多重检测,减少样品消耗,提高空间分辨率,下降操作复杂度,缩短测定时间,提高样品通量。Feng等制造了IA型一次性纸基还原双极电极(BPE)阵列检测多种病原体DNA,组装在BPE阴极上的发夹结构DNA与互补靶DNA结合,与铂纳米颗粒 (PtNPs)标记的探针DNA杂交,经PtNPs催化的氧气被还原产生电化学发光信号,这种基于纸张的BPE阵列传感器实现了对梅毒螺旋体基因、免疫缺陷病毒基因和乙型肝炎病毒基因的多重分析。

结语

纸芯片制作简单,便携性好,样品用量少,本钱低及易集成化等,其研究及运用日趋遭到关注。基于比色法检测的纸芯片易于操作并可直接读出信号,是最常见的检测手段,但其应用常受到低灵敏度的限制;荧光检测较比色法具有更高的灵敏度,但存在严重背景荧光和纸的光散射问题,使测定很难直接在纸芯片上进行。化学发光法不需外加光源,灵敏度较高,仪器设备简单,易于实现微型化和集成化,但需黑暗的检测环境,且大多数检测器价格昂贵,寻求低成本的检测器照旧是研究的关键。电化学发光方法简单,灵敏度高,易于定量,环境光独立以及纸张干扰低等,逐渐被应用于纸芯片,但电化学发光纸芯片几乎所有现有器件都需要昂贵的恒电位仪,将电极添加到检测区域会增加复杂性和每次测试的成本,发展基于纸芯片平台的低成本的检测装备和纸芯片制备方法是该领域的重要研究方向。见表1。

表1 四种微流控纸芯片检测方法的特点

近几年纸芯片的研究逐年增加,但其商业化进程仍然存在较多问题。现有研究中常常忽视不同测试条件(如温度、湿度、环境光、样品基质的复杂度)下的性能分析,而这些对纸芯片的现场即时检测非常重要,该方法的稳定性和干扰因素研究是推动病原体检测纸芯片发展的关键问题之一。纸芯片作为一种微全分析系统,其在样品的分离、富集、反应、检测方面的功能并不是很完备,尤其对复杂多体系的组分很难实现同步检测,研发纸芯片同步相应检测方法,实现对复杂多体系组分的检测也是日后的研究方向。为了改善纸芯片的分析性能,往往涉及到多种化学试剂的使用和多步预处理操作,这增加了检测流程的复杂性,实现检测流程标准化也是研究的一个方向。

Kumar等的报告阐述了目前纸芯片发展大多停留在实验室研究阶段,少有纸芯片真正应用于现场即时检测。因此,随着该领域的快速发展,我们通过应用各种技术手段,着力于纸芯片的实际运用,使得未来纸芯片的发展具有更大的影响力。

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